Studierendenlabor

Der Fischembryo-Toxizitätstest, der Daphnien-Immobilisierungstest und der Algenwachstumshemmungstest – auch als „aquatische Trias“ bezeichnet – gehören zu den grundlegenden Tests, die im Studentenlabor „Goethe Goes Environment“ durchgeführt werden. Studierende und wissenschaftliche Mitarbeiter geben in den folgenden Abschnitten einen kurzen Überblick über die einzelnen Tests.

Fischembryo-Toxizitätstest (FET)

Eines der Hauptziele hier bei E3T ist es, den Empfehlungen des 3R-Konzepts in der Tierversuchspraxis zu folgen. Das 3R-Prinzip umfasst (1) die Reduzierung der Anzahl der verwendeten Tiere, (2) die Verbesserung der Testverfahren und letztendlich (3) den Ersatz von Tierversuchen durch neue alternative Methoden. Der Fischembryo-Toxizitätstest (FET) ist ein Bioassay, der als Alternative zum ursprünglichen akuten Fischtoxizitätstest entwickelt wurde. Der FET wird eingesetzt, um die akute Toxizität von Umweltproben auf das Embryonalstadium von Fischen (Teratogenität) zu bewerten. Der FET hat sich als neuartiges Instrument in der ökotoxikologischen Forschung etabliert und ist ein bewährtes Testverfahren, das in mehreren internationalen Richtlinien (DIN EN ISO 15088: 2009-06 und OECD-Test Nr. 236) validiert wurde.

Der FET wird mit Embryonen des Zebrafisches (Danio rerio) durchgeführt, einem hervorragenden Modellorganismus für ökotoxikologische Studien. Zebrafische sind leicht zu halten und können sich das ganze Jahr über fortpflanzen. Ein Gelege kann bis zu 200–300 Eier enthalten und die Regenerationszeit der weiblichen Fische ist relativ kurz. Die Hauptvorteile sind jedoch das transparente Chorion, das eine einfache Untersuchung des Embryos ermöglicht, die schnelle Embryonalentwicklung und die hohe Empfindlichkeit gegenüber Umweltgiften.
Der FET wird in kleinen Glasschalen durchgeführt, es wurde jedoch eine miniaturisierte Version unter Verwendung von 96-Well-Platten entwickelt, die Teil unseres aktuellen Assay-Portfolios ist. Beide Versionen untersuchen vier Mortalitätsendpunkte (Abbildung 1):

   Koagulation
   Fehlender Herzschlag
   Ausbleibende Ablösung des Schwanzes
   Ausbleibende Somitenbildung (nur OECD 236)

Zusätzlich zu diesen Standardendpunkten untersuchen wir auch weitere Endpunkte, um eine spezifischere, auf den Wirkmechanismus ausgerichtete Bewertung von Umweltproben zu ermöglichen.

Neben dem Zebrafisch sind der Süßwasser Medaka (Oryzias latipes) oder die Dickkopfelritze (Pimephales promelas) weitere gängige Arten in der Süßwasser-Ökotoxikologie. Im Gegensatz dazu sind etablierte Standardmodellorganismen für die Meeresumweltforschung eher selten. In diesem Zusammenhang konzentriert sich unsere Forschung auf den im Salzwasser lebenden Medaka (Oryzias melastigma) als aufstrebende alternative Labormodellart für die Brack- und Meeresumwelt. Die Art ist in Südostasien endemisch und lässt sich unter Laborbedingungen leicht züchten. O. melastigma teilt einige der Hauptvorteile für Embryotests mit D. rerio, insbesondere ein transparentes Chorion und eine kurze Zeitspanne von der Befruchtung bis zum Schlüpfen (8–10 Tage). Weitere Vorteile für Tests an frühen Lebensstadien (ELS) und „OMICs“ sind das ganzjährige Laichen, ein vollständig sequenziertes Genom und eine einfache Geschlechtsgenotypisierung. Diese Kombination von Merkmalen qualifiziert O. melastigma als Modellart in der marinen Ökotoxikologie, wodurch sie als wichtige marine Ergänzung zur Süßwasserart D. rerio angesehen werden kann. Unsere Abteilung arbeitet an der weiteren Etablierung von O. melastigma als marine Modellart und Alternative für Meerestiere in Biotests und der Risikobewertung. Mögliche Anwendungsbereiche von O. melastigma könnten die ökotoxikologische Bewertung von Ölverschmutzungen im Meer oder von neurotoxischen Verbindungen umfassen. Der in unserem Labor durchgeführte marine FET mit O. melastigma wurde gemäß dem standardisierten Zebrafisch-Verfahren (DIN EN ISO 15088: 2009-06 und OECD-Test Nr. 236) angepasst.

 Gemäß der EU-Richtlinie 2010/63/EU gilt die FET bis zum Zeitpunkt der selbstständigen Nahrungsaufnahme als tierversuchsfrei. Da Zebrafisch- und Medaka-Embryonen kurz nach dem Schlüpfen mit der Nahrungsaufnahme beginnen können, beenden wir die limnische bzw. marine FET 5 bzw. 8 Tage nach der Befruchtung (dpf).

Ökotoxizitätstests mit der Gemeinen Wasserfloh, Daphnia magna

Daphnia sp. (Wasserfloh) ist eine Schlüsselart in aquatischen Ökosystemen und gehört zur Gruppe der planktonischen Krebstiere, die in Süßwasserlebensräumen leben. Daphnien sind aufgrund ihrer Größe, ihrer einfachen Kultivierbarkeit, ihres einzigartigen parthenogenetischen (asexuellen) Fortpflanzungszyklus (d. h. der Erzeugung genetisch klonaler Nachkommen durch die Mutter), der Verfügbarkeit standardisierter Testmethoden und ihrer hohen Empfindlichkeit gegenüber Umweltkontaminanten ein hervorragender Modelltestorganismus für Ökotoxizitätstests. Zusammen mit Algen und Fischen sind Daphnien Teil einer Modellnahrungskette, die oft als „aquatische Trias“ bezeichnet wird (Abbildung 3), und stellen die Primärkonsumenten dar.

 Durch die Bewertung der ökotoxikologischen Auswirkungen von Chemikalien auf diese drei Organismen lassen sich die Auswirkungen auf das Ökosystem in Bezug auf dieses vereinfachte Nahrungskettenmodell vorhersagen. In unserem Labor führen wir zwei verschiedene Arten von ökotoxikologischen Tests mit Daphnia magna gemäß den Standard-Testrichtlinien durch:

  - OECD 202 (2004) „Daphnia sp. Akuter Immobilisierungstest“ (akut, 48 Stunden)
  - OECD 211 (2012) „Daphnia magna Reproduktionstest“ (chronisch, 21 Tage)

Diese Tests können wichtige Informationen über die akuten und chronischen Auswirkungen von Chemikalien auf diese Modelltestorganismen liefern.
Der 48-Stunden-Immobilisationstest mit Daphnia magna wird mit weniger als 24 Stunden alten Jungtieren durchgeführt, die typischerweise einer Kontrollbehandlung, gegebenenfalls einer Lösungsmittelkontrolle und den Expositionsbehandlungen ausgesetzt werden. Ein Testlauf umfasst 5 Individuen pro Replikat und 4 Replikate pro Konzentration. Am Ende des Tests wird die Anzahl der immobilisierten Individuen ermittelt. Wurde ein dosisabhängiger Effekt beobachtet, kann eine 48-Stunden-Wirkkonzentration der Probe bestimmt werden, die die Immobilisierung von 50 % der exponierten Daphnien verursacht (EC50).

Im Gegensatz dazu wird der chronische Reproduktionstest über einen Zeitraum von 21 Tagen mit weniger als 24 Stunden alten Neonaten durchgeführt. Pro Gefäß wird ein Tier der Kontrollgruppe, der Lösungsmittelkontrolle oder einer Konzentration der Probe ausgesetzt, wobei pro Versuch 10 Replikate (insgesamt 10 Tiere) verwendet werden. Die Trennung der Tiere in einzelne Gefäße ermöglicht die Bestimmung der Fortpflanzungsleistung während des 21-tägigen Tests. Hierbei werden täglich Daten zu Überleben, Anzahl der pro Elterntier geborenen lebenden Nachkommen, Geschlechtsbestimmung der Neonaten, Anzahl der Bruten (Freisetzung des Neonaten-Gelege) und Körperlänge der weiblichen adulten Tiere am Ende des Versuchs erfasst (Abbildung 4). Die toxische Wirkung der Testsubstanz auf die Fortpflanzungsleistung wird als ECx-Wert ausgedrückt, der durch Anpassung der Daten an ein geeignetes Modell mittels nichtlinearer Regression berechnet wird. Damit lässt sich die Konzentration abschätzen, die jeweils eine x-prozentige Verringerung der Fortpflanzungsleistung verursachen würde. Alternativ kann die Wirkungsschwelle als NOEC/LOEC-Wert (No or Lowest Observed Effect Level) ausgedrückt werden. 
 

 Zeitreisen mit Daphnien:

Daphnia sp. sind im wissenschaftlichen Bereich der Paläoökologie besonders nützlich, da die Weibchen zyklische Parthenogenetiker sind, die sich in der Regel asexuell fortpflanzen. Ungünstige Bedingungen (d. h. Stress) veranlassen weibliche Daphnien dazu, auf sexuelle Fortpflanzung umzuschalten, wodurch männliche Daphnien entstehen. Die sexuelle Fortpflanzung von Daphnia sp. führt zu befruchteten, gekapselten Ruheeiern (Diapause), die durch ein Ephippium geschützt sind und oft auf den Grund sinken, wo sie häufig eine historische Ansammlung ruhender Ephiprien bilden. Eingegraben und im Sediment verborgen können diese Eier Jahrhunderte überdauern und auf bessere Umweltbedingungen warten, um zu schlüpfen und zur Wiederherstellung der Population beizutragen. Sie können über Sedimentkerne gesammelt werden, was dabei hilft, ihr ungefähres Alter zu bestimmen und unter idealen, im Labor nachgebildeten Bedingungen ausgebrütet (d. h. wiederbelebt) werden. Aufgrund des zyklischen parthenogenetischen Fortpflanzungszyklus der Daphnien können isoklonale Linien historischer Daphnia sp. im Labor zu Testzwecken gezüchtet werden. Die wiederbelebten Daphnien weisen zwei einzigartige Merkmale auf: Erstens repräsentieren sie historisch die natürliche genetische Vielfalt ihrer Art in der Umwelt; zweitens repräsentieren sie die genetischen Unterschiede und Veränderungen im Lebenszyklus, die möglicherweise über Generationen hinweg und im Laufe der Evolution stattgefunden haben. So können wir die evolutionären Entwicklungen und Anpassungen von Daphnia sp. im Hinblick auf chemische Verschmutzung darstellen und diese mit ihren heutigen Nachkommen vergleichen. 

Test zur Hemmung des Algenwachstums mit Süßwasseralgen

Der Test zur Hemmung des Algenwachstums soll Aufschluss über mögliche schädliche Auswirkungen von Proben auf das Algenwachstum geben. Algen, die unter kontrollierten Bedingungen exponentiell wachsen, werden 72 Stunden lang einer unbekannten Substanz oder einem Gemisch von Substanzen ausgesetzt. Die behandelten Proben werden mit unbehandelten Negativkontrollen verglichen, um die Hemmung der Wachstumsrate zu bestimmen. Der Algenwachstumshemmungstest kann mit verschiedenen Algenarten durchgeführt werden, z. B. Pseudokirchneriella subcapitata oder Desmodesmus subspicatus.

Der 72-Stunden-Test wird mit Algen während der Phase des exponentiellen Wachstums durchgeführt. Die Algen werden in 24-Well-Platten exponiert, und ihre Wachstumsrate wird alle 24 Stunden fluorometrisch bestimmt.  

Verwendete Ausrüstung

Bei der Vorbereitung der großen Mengen an Expositionsmedium waren die manuellen Pipetten STARLAB ErgoOne eine große Hilfe. Die Pipetten sind dank ihres ergonomischen Griffs und des geringen Kraftaufwands schnell und einfach zu handhaben. 

Aufgrund der geringen Größe und der empfindlichen transparenten Strukturen von D. magna, Zebrafischen und Medaka war die Arbeit mit den Leica-Mikroskopen besonders angenehm. Die hervorragende Ausleuchtung der Organismen und die scharfen Bilder der integrierten Kamera erleichterten die Unterscheidung zwischen männlichen und weiblichen Daphnia-Nachkommen sowie die Auswertung der FET-Endpunkte.